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细胞培养方法
添加时间:2017-12-29 14:27:08   点击次数:  1408  次

细胞培养方法

1、收到细胞,请查看瓶子是否有破裂,培养基是否漏出,是否浑浊,如有请尽快联系。

2、收到细胞,如包装完好,请在显微镜下观察细胞。,由于运输过程中的问题,细胞培养瓶中的贴壁细胞有可能从瓶壁中脱落下来,显微镜下观察会出现细胞悬浮的情况,出现此状态时,请不要打开细胞培养瓶,先不要把培养基吸出来。应立即将培养瓶置于细胞培养箱里静止3-5小时左右,让细胞先稳定下,再于显微镜下观察,此时多数细胞会重新贴附于瓶壁。如细胞仍不能贴壁,请用台盼蓝染色法鉴定细胞活力,如台盼蓝染色证实细胞活力正常请按悬浮细胞的方法处理

3. 收到细胞时如无异常情况 ,请在显微镜下观察细胞密度,如为贴壁细胞,未超过80%汇合度时,用75%酒精(建议配置75%酒精的水也是灭菌超纯水。喷洒整个瓶消毒后放到超菌台内,严格无菌操作:然后打开盖子,先用枪头把培养基吸出10ML左右,放在离心管里,然后瓶口过火,(严禁直接倾倒),这样可以保证不污染,再用10ML的移液管,将剩余的培养基全部吸出,放于离心管中,培养瓶中只剩余5-10ML左右培养液继续培养就可以了):超过80%汇合度时,请按细胞培养条件传代培养。

如为悬浮细胞,吸出培养液,1000转/分钟离心3-5分钟,吸出上清,管底细胞用新鲜培养基悬浮细胞后移回培养瓶。

4,将培养瓶置于37℃培养箱中培养,盖子微微拧松。吸出的培养基可以保存在灭菌过的瓶子里,存放于4℃冰箱,以备不时之需。第二天换液时,要配制新鲜的培养基和进口胎牛血清。这样对细胞生长更好。不要再用我们原瓶的培养基了。

5 24小时后,细胞形态已恢复并贴满瓶壁,就可以传代了。(贴壁细胞)将培养瓶里的培养基倒去,加3-5ml(以能覆盖细胞生长面为准)PBS或Hanks’液洗涤后弃去。加0.5-1ml  0.25%含EDTA的胰酶消化,消化时间以具体细胞为准,一般1-3分钟,不超过5分钟。可以放入37℃培养箱消化。轻轻晃动瓶壁,见细胞脱落下来,加入3-5ml培养基终止消化。用移液管轻轻吹打瓶壁上的细胞,使之完全脱落,然后将溶液吸入离心管内离心,1000rpm/5min。弃上清,视细胞数量决定分瓶数,一般一传二,如细胞量多可一传三,有些细胞不易传得过稀,有些生长较快的细胞则可以多传几瓶,以具体细胞和经验为准。(悬浮细胞)用移液管轻轻吹打瓶壁,直接将溶液吸入离心管离心即可。

6,贴壁细胞 ,悬浮细胞。严格无菌操作。换液时,换新的细胞培养瓶和换新鲜的培养液和进口胎牛血清37度    5%CO2 培养

7.  收到细胞后,请镜下观察细胞,用恰当方式处理细胞。若悬浮的细胞较多,请离心收集细胞,接种到一个新的培养瓶中。弃掉原液,使用新鲜配制的培养基,使用进口胎牛血清. 刚接到细胞,若细胞不多时 血清浓度可以加到15去培养。若细胞迏到80%左右 ,血清浓度还是10%。

 

         细胞培养条件

11640培养基(GIBCO,货号11875093 +10%进口胎牛血清(GIBCO,货号10099141+2mM  L-G(L-谷氨酰胺)+1mM  Sodium pyruvate+10mM   HEPES(gibco.。货号。15630-080)

2,DMEM高糖培养基(GIBCO,货号11995065+10%进口胎牛血清(GIBCO,货号10099141+4mM  L-G(L-谷氨酸胺)+1mM (丙酮酸钠1,HEPES(gibco.。货号。15630-080)

3,E,MEM培养基(GIBCO,货号11095080+10%进口胎牛血清(GIBCO,货号10099141+NEAA(非必需氨基酸)+2mM  L-G(L-谷氨酸胺)+1mM (丙酮酸钠)

 

4F12K培养基 (GIBCO,货号11765054+10%进口胎牛血清(GIBCO,货号10099141+2mM  L-G(L-谷氨酸胺)

 

5McCoy's 5a培养基(GIBCO,货号16600082+10%进口胎牛血清(GIBCO,货号10099141+1.5mM  L-G(L-谷氨酸胺)

 

6 . L 15培养基(Hyclone,货号SH30525.01+10%进口胎牛血清(GIBCO,货号10099141+1.5mM  L-G(L-谷氨酸胺)

 

7. DMEM/F12培养基(GIBCO,货号11330032+10%进口胎牛血清(GIBCO,货号10099141+1.5mM  L-G(L-谷氨酸胺)

 

8. IMDM培养基(GIBCO,货号C12440500BT+10%进口胎牛血清(GIBCO,货号10099141+1.5mM  L-G(L-谷氨酸胺)

 

 

 

2, L-G(L-谷氨酸胺)L-Glutamine 200mM  (GIBCO。货号25030-081)

3,NEAA(非必需氨基酸).(GIBCO。货号11140-050)

4..sodium.pyruvate  (GIBCO。货号11360-070)   

 

100ML 1640完全培养基配法
1640培养基   86ML  

 FBS 血清        10ML       

 L-谷氨酸胺。100X  1ML
丙酮酸钠  100X        1ML

HEPES(1M) 10mM  1ML   

抗菌素(青、链霉素) 1ML

 
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